PHÁT HIỆN VI KHUẨN BARTONELLA ĐẦU TIÊN TRÊN CHUỘT Ở VIỆT NAM

 

Hoàng Kim Loan1, Michael Kosoy2, Cao Bảo Vân1,
Nguyễn Thái Hiệp1 và Nguyễn Thị Kim Tiến1.

1 Viện Pasteur TP HCM,
2 Trung tâm ngăn ngừa và pḥng chống dịch bệnh Hoa Kỳ, Ft. Collins, Colorado.

 

GIỚI THIỆU

Vi khuẩn Bartonella gây một số bệnh khác nhau, hầu hết là ở động vật, nhưng những nghiên cứu gần đây đă cho thấy một số chủng gây bệnh trên người (B. henselae, B. quintana, B. elizabethae, B. vinsonii subsp). Những căn bệnh do vi khuẩn này gây ra liên quan đến hàng loạt dấu hiệu và triệu chứng, bao gồm nhiễm khuẩn hay tái phát, sốt, loét da, viêm màng trong tim, và những biểu hiện bệnh khác ở hệ thần kinh trung ương, gan, mắt và mô xương(1).

Bartonella là vi khuẩn Gram âm, mọc chậm trên môi trường thạch máu, bao gồm 16 loài(4).

Là một bệnh khó chẩn đoán với nhiều triệu chứng khác nhau, những kỹ thuật trong pḥng thí nghiệm giúp xác định hay loại trừ trong chẩn đoán đang ngày càng quan trọng hơn. Bên cạnh kỹ thuật nuôi cấy và phân lập được áp dụng trong thập kỷ qua, hiện nay các xét nghiệm về huyết thanh học như: IFA, EIA cũng đă được ứng dụng. Các kỹ thuật ở mức độ phân tử như: PCR, DNA microarrays, DNA sequences, và mẫu ḍ lai ghép đặc hiệu, điện di đa chiều cũng đă được áp dụng trong chẩn đoán và nghiên cứu(2).

Ở châu Á, vi khuẩn Bartonella đă được báo cáo ở Indonesia, Nhật, Philippines, Trung Quốc và Thái Lan, với sự phân bố của chủng B. henselae, B. clarridgeiae, B.indica và Bartonella cùng nhóm với B.Elizabethae (1)

Bài báo cáo này là những kết quả phát hiện đầu tiên vi khuẩn Bartonella ở Việt nam, nhưng đă thu được một số kết quả đáng chú ư.

VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

1. Phân lập

Qui tŕnh nuôi cấy và định danh vi khuẩn Bartonella được thực hiện theo đúng tiêu chuẩn nghiên cứu về vi khuẩn Bartonella trên chuột tại Hoa Kỳ.

Mẫu máu chuột từ thực địa được bảo quản trong Nitơ lỏng cho đến khi chuyển đến Trung tâm kiểm soát dịch bệnh Hoa Kỳ, Colorado. Máu chuột được pha loăng 1:4 trong BHI lỏng có bổ sung thuốc chống nấm, sau đó cấy lên môi trường thạch máu thỏ, ủ 35°C, 5% CO2, tiến hành ủ và theo dơi khoảng 3 tuần. Vi khuẩn Bartonella được gặt lấy sau một đến bốn lần cấy chuyển.(5)

2. Định danh bằng kỹ thuật PCR

Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase chain reaction –PCR) sẽ được tiến hành để xác định những vi khuẩn từ môi trường phân lập có h́nh dạng khuẩn lạc được nhận biết là Bartonella. Phản ứng PCR khuếch đại một tŕnh tự đặc hiệu của gen tổng hợp citrate (citrate synthase gene - gltA) của vi khuẩn Bartonella, có kích thước 379 bp.

DNA được tách chiết sẽ tiến hành phản ứng PCR trên máy PTC 200 DNA_Engine, gồm 35 chu kỳ như sau:

ú          95°C trong 30 giây

ú          45°C trong 30 giây

ú          72°C trong 30 giây

Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên gel agarose 1% theo các phương pháp chuẩn(3)

3. Sequencing sản phẩm PCR, phân tích kết quả

Tiến hành thực hiện phản ứng phân tích tŕnh tự gen bằng máy CEQ 8000XL (Beckman Coulter). Quá tŕnh được thực hiện như sau:

-         Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng PCR Purification Kit (Quiagen, Santa Clarita)

-         Phản ứng đánh dấu huỳnh quang đoạn DNA:

ú          96°C trong 15 giây

ú          50°C trong 5 giây

ú          60°C trong 4 giây

được thực hiện trên máy Gene Amp PCR Syctem 9600 thermocycler.

-         Sản phẩm của phản ứng này sẽ được tinh sạch loại bỏ chất nhuộm màu bằng Dye Terminator Removal (Quiage)

-         Tiến hành giải tŕnh tự DNA.

Kết quả giải tŕnh tự đoạn gen glt A được phân tích bằng phần mềm Clustal V (DNASTAR) để phân tích và so sánh những tŕnh tự từ chủng đă phân lập với những chủng Bartonella hiện có trong Genbank.(5),(6),(7).

KẾT QUẢ

1. Phân lập

Phân lập được 8 chủng vi khuẩn Bartonella trong tổng số 100 mẫu máu chuột. Trong đó có:

1 chủng phân lập từ S.murinus

2 chủng phân lập từ R. norvegicus

5 chủng phân lập được từ R. exullan

2. Xác định bằng PCR

Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen glt A đă xác định các vi khuẩn phân lập được là Bartonella.

3. Phân tích kết quả giải tŕnh tự DNA

Những chủng sau khi được xác định là Bartonella bằng kỹ thuật PCR được tiến hành giải tŕnh tự DNA và phân tích kết quả trên phần mềm Clustal V, sau đó so sánh với các tŕnh tự của vi khuẩn Bartonella có trong GenBank.

Kết quả: Tất cả các mẫu Bartonella phân lập được từ Việt nam đều nằm trong cùng một nhánh song song với B. Elizabethae U28072 (phân lập trên bệnh nhân ở Massachusetts) và Bartonella khác phân lập từ R.norvegicus (phân lập ở Lousiana) trong cây phát sinh loài của vi khuẩn Bartonella.

Đáng chú ư, có một chủng phân lập từ S.murinus cho kết quả là chủng B.elizabethae (phần trăm định danh là 96.7%).

BIỆN LUẬN

Đây là những phát hiện đầu tiên vi khuẩn Bartonella ở Việt Nam nhưng có ư nghĩa quan trọng v́ kết quả phân tích và so sánh của gene glt A cho thấy có sự hiện diện chủng B.elizabethae ở Việt Nam. B. elizabethae là một trong những chủng vi khuẩn Bartonella gây bệnh cho người. Với kết quả nghiên cứu này, hy vọng sẽ mở ra nhiều hướng nghiên cứu mới đáng quan tâm về Bartonella trên sức khỏe cộng đồng ở Việt Nam cũng như những nghiên cứu sâu hơn về sinh thái học và di truyền học của Bartonella ở nước ta.

 

[Trở về]

 

Copyright 2003 by Pasteur Institute In HCM, All rights reserved. Contact us : pasteur@pasteur-hcm.org.vn
167 Pasteur Street, District 3, HoChiMinh City, Vietnam. Tel : (84-8) 8200739 - Fax : (84-8) 8231419.