XÂY DỰNG VÀ CHUẨN HÓA BỘ KIT PHÁT HIỆN
C. trachomatis VÀ N. gonorrhoeae TRONG BỆNH PHẨM

Cao Thị Bảo Vân, Võ Hồ Hồng Hải, Ngô Chung Chỉnh và cs.

Phòng Sinh học phân tử – Viện Pasteur TPHCM

GIỚI THIỆU

Neisseria gonorrhoeae (NG) và Chlamydia trachomatis (CT) là hai tác nhân gây bệnh lây truyền qua đường tình dục phổ biến hiện nay. Sự đồng nhiễm CT và NG chiếm từ 32 – 50% ở nữ và khoảng 20% ở nam. Bệnh nhiễm CT và NG thường không biểu hiện triệu chứng, do đó nếu không được phát hiện, điều trị kịp thời sẽ làm tăng nguy cơ lây nhiễm và để lại nhiều biến chứng, di chứng nặng nề.

Trên thị trường thế giới đã có một số bộ xét nghiệm thương mại (bộ kit) áp dụng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR, SDA, TMA, LCR…) phát hiện CT và NG như Roche Amplicor, BDProbeTecET, Gen-Probe APTIMA, LCx… Ưu điểm của phương pháp khuếch đại gen là độ nhạy, độ đặc hiệu cao và có thể áp dụng cho hầu hết các loại mẫu bệnh phẩm, đặc biệt là mẫu không xâm lấn như nước tiểu. Đặc điểm này giúp việc lấy mẫu dễ dàng, thuận lợi cho việc giám sát trên một số lượng lớn bệnh nhân. Tuy nhiên, giá thành bộ kit nước ngoài còn khá cao. Việc nghiên cứu chế tạo bộ kit giúp phát hiện nhanh và chính xác hai vi khuẩn này với giá thành hạ để có thể áp dụng trong điều kiện nước ta hiện nay là một vấn đề cần quan tâm.

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm xây dựng và chuẩn hóa quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia trachomatis và Neisseria gonorrhoeae trong mẫu bệnh phẩm; bước đầu chế tạo bộ sinh phẩm phát hiện và triển khai thử nghiệm thực địa.

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

-        ADN của chủng chuẩn (C. trachomatis L2 và N. gonorrhoeae 18243): cung cấp bởi phòng thí nghiệm Biobanque de Picardie, Pháp.

-        50 chủng NG phân lập từ bệnh phẩm, được cung cấp bởi Bệnh viện Da Liễu
TP. HCM.

-        15 chủng Salmonella OMA, Samonella OMB, S. paratyphi B, S. typhi, S. feacalis, S. Sonnei, P. aeruginosa, H. influenza, E. coli, C. pneumoniae, C. psittaci, K. pneumoniae, B. subtilis, B. cereus, S. aureus (cung cấp bởi bệnh viện Nhi Đồng I và II, Chợ Rẫy, Viện Pasteur TP. HCM).

-        30 mẫu được xác định âm tính với C. trachomatis và N. gonorrhoeae kiểm tra bằng kit của Roche.

-        200 mẫu bệnh phẩm (100 mẫu phết cổ tử cung, 100 mẫu nước tiểu) lấy từ 100 bệnh nhân nữ đến khám tại bệnh viện Hùng Vương và bệnh viện Phụ sản Từ Dũ.

CÁC BƯỚC XÂY DỰNG VÀ CHUẨN HÓA

-        Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm, tách chiết AND.

-        Phương pháp Multiplex PCR dựa trên chủng chuẩn (CT L2 và NG 18243).

-        Thiết kế và tạo dòng chứng dương (plasmis pIPCTL2, plasmid pIPNG18243).

-        Thiết kế, tạo dòng, xác định ngưỡng chứng nội tại (ICNG).

-        Quy trình lai ghép trên giá thể rắn dựa trên chủng chuẩn (PCR-ELISA).

-        Xác định ngưỡng dương tính.

-        Thử nghiệm độ đặc hiệu, thử nghiệm độ lặp lại của phản ứng.

-        Chế tạo bộ kit mẫu và thử nghiệm trên mẫu bệnh phẩm.

KẾT QUẢ

Hình 1. và 2. là một phần kết quả thiết lập và chuẩn hóa phản ứng PCR và Multiplex PCR trên ADN chủng chuẩn. Kết quả này cho thấy trong điều kiện đã chọn hai cặp mồi CP24-CP27 và NG1-NG2 kết hợp tốt, đặc hiệu, không tương tác, không ức chế lẫn nhau (trừ trường hợp sự chênh lệch nồng độ AND của hai tác nhân CT và NG là rất lớn).

Biểu đồ 2. cho thấy hiệu quả khuếch đại một mình ADN CT L2 ở cả 5 độ pha loãng đa số tốt hơn trường hợp khuếch đại chung với ICNG. Khi nồng độ CT L2 giảm dần thì tín hiệu ICNG tăng dần. Mặc dù có cạnh tranh nhưng không xảy ra sự ức chế giữa ADN CT L2 và ICNG. Nồng độ AND CT mục tiêu thấp nhất có thể phát hiện được: 0,2pg/µl.

Biểu đồ 3. cho thấy có sự cạnh tranh giữa các ADN mục tiêu. Sự cạnh tranh thấy rõ khi NG 18243 và CT L2 được pha loãng ở mức 10-3, 10-4 và 10-5. So sánh giữa ICNG 0,1pg/µl và 0,01pg/µl ta thấy hiệu quả khuếch đại CT L2 và NG 18243 không tăng lên rõ trong khi OD ICNG 0,01pg/µl lại thấp hơn nhiều so với ICNG 0,1pg/µl. Do đó nồng độ ICNG thích hợp được sử dụng: 0,1pg/µl. c chọn

Biểu đồ 4. cho thấy kết quả thu được ở mỗi lần lặp lại (4 lần) gần tương đương nhau chứng tỏ quy trình đã ổn định.

KẾT LUẬN

-        Quy trình Multiplex PCR có độ phát hiện: 4pg/µl (NG) và 2pg/µl (CT).

-        Quy trình lai ghép trên giá thể rắn (PCR-ELISA) có độ phát hiện: 0,4pg/µl (NG), 0,2pg/µl (CT).

-        Ngưỡng dương tính của NG là OD # 0,2 A405nm, CT là OD # 0,2 A405nm, mẫu bị ức chế khi OD ICNG < 0,2 A405nm.

-        Tạo dòng chứng dương CT: plasmis pIPCTL2, chứng dương NG: plasmid pIPNG18243, chứng nội ICNG: plasmid pIPICNG.

-        Kết quả xác định tính đặc hiệu bằng cách thử nghiệm phản ứng PCR-ELISA với trên 15 chủng vi khuẩn khác loài cho thấy không có phản ứng chéo xảy ra.

-        Kết quả thử nghiệm độ lặp lại của quy trình PCR-ELISA cho thấy các thành phần điều kiện phản ứng đã ổn định.

-        Thử nghiệm trên 200 mẫu bệnh phẩm thu thập từ bệnh viện (gồm 100 mẫu phết cổ tử cung, 100 mẫu nước tiểu) cho hiệu quả phát hiện tương đương kit Amplicor (Roche)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.      Dalesio, N. , V. Marsiglia, A. Quinn, T. C. Quinn, and C. A. Gaydos. 2004. Performance of the MagNA Pure LC Robot for Extraction of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae DNA from Urine and Swab Specimens. J. Clin. Microbiol. 42:3300-3302.

2.      Hai V. H. H. , J. Orfila, V. Cao, F. Betsou. 2005. Use of internal control DNA in multiplex polymerase chain reaction amplification of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae DNA. J. Clin. Microbiol.

3.      Hall, G. S. 2005. Molecular diagnostic methods for detection of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis. Reviews in Med Microbiol. 16:69-78.

4.      Johnson, R. E. , W. J. Newhall, J. R. Papp, J. S. Knapp, C. M. Black, T. L. Gift, R. Steece, L. E. Markowitz, O. J. Devine, C. M. Walsh, S. Wang, D. C. Gunter, K. L. Irwin, S. DeLisle, and S. M. Berman. Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections 2002. MMWR Recomm. Rep. 18;51(RR-15):1-38; quiz CE1-4.

5.      Mahony, J. B. , K. E. Luinstra, M. Tyndall, J. W. Sellors, J. Krepel, and M. Chernesky. 1995. Multiplex PCR for detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in genitourinary specimens. J. Clin. Microbiol. 33: 3049-3053.

6.      Mullick, S. , D. W. Jones, M. Beksinska, and D. Mabey. 2005. Sexually transmitted infections in pregnancy: prevalence, impact on pregnancy outcomes, and approach to treatment in developing countries. Sex. Transm. Infect. 81:294-302.

7.      Pol, B. V. D. , T. C. Quinn, C. A. Gaydos, K. Crotchfelt, J. Schachter, J. Moncada, D. Jungkind, D. H. Martin, B. Turner, C. Peyton, R. B. Jones. 2000. Multicenter evaluation of the Amplicor and automated Cobas Amplicor CT/NG tests for detection of Chlamydia trachomatis. J. Clin. Microbiol. 38:1105-1112.

8.      WHO. 2001. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections overview and estimates.

ESTABLISHMENT AND STANDARDISATION OF A DIAGNOSTIC KIT FOR DETECTION OF Chlamydia trachomatis AND Neisseria gonorrhoeae
IN CLINICAL SAMPLES

Cao Thi Bao Van, Vo Ho Hong Hai, Ngo Chung Chinh, et al.

Laboratory of Molecular Biology – Pasteur Institute of HoChiMinh City

ABSTRACT

We established and standardised a multiplex PCR and hybridization assay (PCR-ELISA) for the simultaneous detection of C. trachomatis and N. gonorrhoeae in clinical samples. An internal control was designed to avoid false negative results. PCR-ELISA obtained a sensitivity of 0,2 pg/µl of C. trachomatis DNA and 0,4 pg/µl of N. gonorrhoeae DNA. The ChlamyGo kit, which based on this PCR-ELISA procedure, was developed and evaluated futher by testing on 200 clinical specimens. The ChlamyGo kit can be applied for the national screening programs of C. trachomatis and N. gonorrhoeae infections.