PHÁT HIỆN PNEUMOCYSTIS JIVEROCI TRÊN BỆNH NHÂN NHIỄM HIV BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG

Diệp Thế Tài⁽¹⁾, Lê Thị Cẩm Tú⁽¹⁾, Nguyễn Thị Phương Lan⁽¹⁾, Nguyễn Thị Kim Hoàng⁽¹⁾,

Mai Nguyệt Thu Huyền⁽²⁾, Nguyễn Thị Ngọc Lan⁽²⁾, Nguyễn Hồng Đức⁽²⁾,

Maryvonne Maynart⁽³⁾ Yves Germani⁽³⁾, Trương Xuân Liên⁽¹⁾

(1) Viện Pasteur TP. HCM, (2) Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch TP. HCM, (3) Viện Pasteur Paris

Tóm tắt

Ba loại bệnh phẩm dịch rửa phế nang-phế quản, đàm kích thích, và đàm khạc sâu được thu thập ở 36 bệnh nhân HIV có biểu hiện viêm phổi để phát hiện nhiễm Pneumocystis jiveroci (PJP) bằng phương pháp PCR và miễn dịch huỳnh quang. Trên bệnh phẩm dịch rửa phế nang-phế quản, tỉ lệ phát hiện PJP bằng PCR là 64% so với miễn dịch huỳnh quang là 53%. Trong 36 mẫu đàm kích thích, tỉ lệ phát hiện P. jiveroci bằng PCR là 53% so với miễn dịch huỳnh quang là 36%. Ở mẫu đàm khạc sâu tỉ lệ phát hiện bằng kỹ thuật PCR là 39% so với 28% bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang. PCR là một công cụ hữu ích trong việc chẩn đoán nhanh PJP trên nhóm bệnh nhân HIV có triệu chứng viêm phổi.

Từ khóa Pneumocystis jiveroci, bệnh nhân HIV dương, đàm khạc sâu (SPU), đàm kích thích (IS), dịch rửa phế quản phế nang (BAL), PCR, miễn dịch huỳnh quang.

Đặt vấn đề

Pneumocystis jiveroci (trước đây được gọi là Pneumocystis carinii) (PJP) là một tác nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ hội thường gặp trên nhóm bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Trên 60% các trường hợp viêm phổi ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS có liên quan tới PJP [3]. Tỉ lệ nhiễm PJP trên bệnh nhân HIV là 18,3% theo một nghiên cứu của ANRS 1260, và 27% theo một nghiên cứu gần đây về các tác nhân gây bệnh viêm phổi trong 8 tháng đầu năm 2005 [1]. Theo nhóm tác giả này, tỉ lệ nhiễm PJP là cao cho thấy sự cần thiết của điều trị dự phòng tích cực và hướng xử trí lâm sàng thích hợp. Chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời các trường hợp viêm phổi do PJP góp phần cải thiện tình trạng sức khỏe và chất lượng sống cho người bệnh. Xét nghiệm chẩn đoán P. jiveroci còn nhiều khó khăn do không nuôi cấy được mà chủ yếu dựa vào các kỹ thuật nhuộm tế bào trên các mẫu đàm và dịch rửa phế nang-phế quản, đòi hỏi người thực hiện phải có kinh nghiệm, tuy nhiên kết quả còn tùy thuộc vào loại và cách lấy bệnh phẩm. Việc lấy mẫu, nhất là đối với dịch rửa phế nang-phế quản, phụ thuộc vào tình trạng sức khỏe người bệnh cũng như các trang bị hỗ trợ cho việc lấy bệnh phẩm. Sự phát triển của sinh học phân tử đã khắc phục những khó khăn nói trên giúp chẩn đoán P. jiveroci sớm và chính xác hơn. Nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xác định tỉ lệ P. jiveroci trong các mẫu bệnh phẩm đường hô hấp ở những bệnh nhân nhiễm HIV bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang.

Đối tượng và phương pháp

Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh và bệnh viện Phạm Ngọc Thạch trong khoảng thời gian 2003 – 2004.

Thiết kế nghiên cứu

Đây là một nghiên cứu hàng loạt ca với tất cả 36 bệnh nhân chọn được trong suốt thời gian nghiên cứu.

Tiêu chí chọn mẫu

Đối tượng được chọn là những bệnh nhân nhiễm HIV, có các triệu chứng bất thường của chức năng hô hấp, và có ít nhất một bất thường trên hình ảnh X-quang phổi như mờ nhu mô phổi một hoặc nhiều thùy, một hay hai bên, đông đặc phổi, thâm nhiễm một hay hai bên, hội chứng mô kẽ hoặc phế nang-mô kẽ khu trú hoặc lan tỏa.

Thu thập dữ kiện

Lấy mẫu bệnh phẩm

Mỗi bệnh nhân được lấy 3 loại bệnh phẩm là đàm khạc sâu (SPU), đàm kích thích (IS), và dịch rửa phế nang-phế quản (BAL). Đối với mẫu đàm khạc sâu, đàm kích thích phải thỏa những tiêu chuẩn của thang điểm Murray-Washington (Bảng 1).

Bảng 1. Tiêu chuẩn chọn mẫu đàm của Murray-Washington

Do việc lấy bệnh phẩm phụ thuộc vào tình trạng sức khỏe và mức độ hợp tác của bệnh nhân tại thời điểm lấy mẫu, nên các bệnh phẩm đàm khạc sâu phải được đánh giá theo tiêu chuẩn Murray-Washington trước khi thu dung. Đôi khi mẫu phải được lấy lại nhiều lần, do đó, một số bệnh nhân có 3 loại bệnh phẩm được lấy cùng 1 ngày, một số khác có bệnh phẩm được lấy vào những ngày khác nhau, có khi đến 1 tuần. Chi tiết này cũng được xem xét trên kết quả xét nghiệm bằng cả hai phương pháp miễn dịch huỳnh quang và PCR.

Xử lý mẫu và tách chiết DNA

Các mẫu đàm khạc sâu, đàm kích thích được hóa lỏng trong DTT 1% trong hai giờ, sau đó 200ml dung dịch đàm đã hóa lỏng và dịch rửa phế nang-phế quản được dùng tách chiết DNA theo quy trình của Roche.

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang và PCR

Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang được thực hiện với bộ kit MonoFluo P. carinii của Bio-Rad có độ nhạy cảm là 100% và độ đặc hiệu là 95,8% [8]. Cả ba loại bệnh phẩm đều được xét nghiệm với cả hai kỹ thuật PCR và miễn dịch huỳnh quang. Đoạn ADN có kích thước 418 bp của gen 18S rRNA PJP được khuyếch đại với các cặp mồi đặc hiệu [1]. Tổng thể tích phản ứng là 25ml, bao gồm các thành phần mastermix 2X, nồng độ mồi sử dụng là 20pm, và 5ml cho khuôn DNA. Chu trình khuếch đại là 50⁰C/10phút; 98⁰C/20phút, 58⁰C/20phút, 72⁰C/20phút (2 chu kỳ), 94⁰C/20phút, 62⁰C/20phút, 72⁰C/45phút (41 chu kỳ), và 72⁰C/5phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%, và quan sát dưới đèn cực tím.

Phân tích dữ kiện

Dữ kiện được nhập bằng phần mềm Excel, xử lý và phân tích bằng phần mềm Epi-Info 6.

Kết quả

Phản ứng PCR được thực hiện trên mẫu thu dung từ bệnh phẩm của bệnh nhân viêm phổi do PJP, và trên các chủng vi khuẩn E. coli, Haemophillus, Toxoplasma gondii, Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus, Klebsiella pneumoniae, Candida albican. Kết quả nhận được PCR chỉ khuyếch đại trên mẫu có PJP, và không cho sản phẩm khuyếch đại trên các chủng vi khuẩn dùng trong nghiên cứu. Như vậy, cặp mồi được dùng trong nghiên cứu rất đặc hiệu cho PJP (Hình 1). Kết quả này phù hợp với một nghiên cứu độc lập khác của nhóm tác giả Angela M. Caliendo [2]. Ngoài ra, PJP được phát hiện ở độ pha loãng là 1/10 từ mẫu dịch rửa phế nang-phế quản ban đầu.

Trong 36 mẫu dịch rửa phế nang-phế quản, tỉ lệ phát hiện P. jiveroci bằng kỹ thuật PCR là 64% (23/36), và chỉ có 53% (19/36) dương tính với kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang. Có 24/36 mẫu cho kết quả phù hợp giữa hai phương pháp. Trong 23 mẫu PCR dương tính có 8 mẫu âm tính trên miễn dịch huỳnh quang, và có 4 mẫu PCR âm tính nhưng dương tính trên miễn dịch huỳnh quang (Bảng 2).

Trong 36 mẫu đàm kích thích tỉ lệ phát hiện được P. jiveroci bằng kỹ thuật PCR cao hơn kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang, 53% so với 36%. Có 24 mẫu có kết quả phù hợp giữa hai phương pháp, trong đó 10 mẫu cùng dương và 14 mẫu cùng âm. Trong 19 mẫu PCR dương tính có 9 mẫu âm tính bằng miễn dịch huỳnh quang (Bảng 3).

Tỉ lệ phát hiện PJP bằng phương pháp PCR ở mẫu đàm khạc sâu là 39% (14/36) so với 28% (10/36) bằng miễn dịch huỳnh quang. Có 30 mẫu cho kết quả tương đồng (Bảng 4).

Bằng phương pháp PCR, có 18 ca (9 dương tính, 9 âm tính) cho kết quả tương đồng giữa 3 loại bệnh phẩm (Hình 2), 18 ca có kết quả tương đồng trong 2 loại bệnh phẩm, trong đó, 14 ca dịch rửa phế nang-phế quản dương tính, và một đàm khạc sâu hoặc đàm kích thích dương tính, 4 ca dịch rửa phế nang-phế quản âm tính, đàm khạc sâu hoặc đàm kích thích dương tính. Với phương pháp miễn dịch huỳnh quang, có 21 ca (5 dương tính, 16 âm tính) tương đồng giữa 3 loại bệnh phẩm (Hình 3), 15 ca có kết quả như nhau trên 2 loại bệnh phẩm, trong đó, 11 ca dịch rửa phế nang-phế quản dương tính và đàm khạc sâu hoặc đàm kích thích âm tính, 4 ca dịch rửa phế nang-phế quản âm tính, đàm khạc sâu hoặc đàm kích thích dương tính.

Bàn luận

Phương pháp PCR phát hiện P. jiveroci ở mẫu đàm khạc sâu có tỉ lệ dương tính cao hơn phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Kết quả này phù hợp với hai nghiên cứu của nhóm tác giả K. Saito và cộng sự (2004), và Angela M. Caliendo (1998). Phương pháp lấy mẫu đàm khạc sâu tương đối đơn giản, và dễ dàng thu thập mẫu cho nghiên cứu. Hiện nay, có một số tác giả còn đề nghị chẩn đoán PJP bằng dịch rửa miệng [4], hoặc có thể phát hiện PJP trong máu toàn phần [6]. Mẫu đàm khạc sâu cũng là một loại mẫu có thể dùng trong chẩn đoán PJP trong trường hợp không thể thu dung dịch rửa phế nang-phế quản, hoặc đàm kích thích.

Mẫu dịch rửa phế nang-phế quản có thể được xem như mẫu chuẩn vàng trong chẩn đoán PJP, điều này cũng được nhóm tác giả Michael Weig ghi nhận khi dùng PCR để chẩn đoán PJP trên những nhóm bệnh nhân khác nhau [7]. Tuy nhiên, từ những kết quả PCR hoặc miễn dịch huỳnh quang ghi nhận được trên 3 mẫu bệnh phẩm của cùng 1 bệnh nhân, ý kiến đề xuất là trong trường hợp dịch rửa phế nang-phế quản âm tính mà biểu hiện lâm sàng nghi ngờ do PJP, hoặc diễn tiến XQ phổi, tiến triển tốt nhanh sau khi điều trị bằng co-trimoxazol vài ngày, nếu cần xác định lại tác nhân nên lấy thêm 1 bệnh phẩm khác (dịch rửa phế nang-phế quản, đàm kích thích, hoặc đàm khạc sâu) để xét nghiệm.

Kết luận

PCR là một công cụ hữu ích trong việc chẩn đoán nhanh PJP trên nhóm bệnh nhân viêm phổi do tác nhân này gây ra. Ngoài ra, để phát hiện chính xác tác nhân gây bệnh, nên lấy hai loại bệnh phẩm khác nhau để tránh trường hợp chẩn đoán thiếu hoặc chẩn đoán không đúng tác nhân gây bệnh.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.      Lê Mạnh Hùng, Lê Hoàng Ninh và cộng sự (2006). Viêm phổi nhiễm trùng trên người lớn nhiễm HIV nhập viện tại thành phố Hồ Chí Minh. Tạp chí thời sự y học: 11-15.

2.      Angela M. Caliendo, Peter L. Hewitt và cộng sự (1998). Performance of a PCR assay for detection of Pneumocystis carinii from respiratory specimens. J. of clinical microbiology, Apr: 979-982.

3.      Jannik Helweg–Larsen (2004). Pneumocystis jiveroci. Danish Medical Bulletin Vol. 51, No. 3.

4.      Jannik Helweg–Larsen (1998). Diagnostic use of PCR for detection of Pneumocystic carinii in oral wash samples. J. Clinical microbiology, July: 2068-2072.

5.      K. Saito, và cộng sự (2004). Detection of Pneumocystis carinii by DNA amplification in patients with connective tissuse diseases: re-evaluation of clinical features of P. carinii pneumonia in rheumatic diseases. Rheumatology 2004; 1

6.      Meja R abodonirina (1999). Detection of Pneumocystis carinii DNA in blood specimens from human immunodeficiency virus–infected patiens by nested PCR. J. of Clinical Microbiology, Jan. : 127-131.

7.      Michael Weig và cộng sự (1997). Usefulness of PCR for diagnosis of Pneumocystis carinii Pneumonia in different patient groups. J. of Clinical Microbiology, June, p. 1445-1449.

8.      Monofluo Kit P. carinii 72730, BIO-RAD.

DETECTION OF PNEUMOCYSTIS JIVEROCI IN HIV POSITIVE PATIENTS
BY PCR AND IMMUNO-FLUORESCENCE

Diep The Tai⁽¹⁾, Le Thi Cam Tu⁽¹⁾, Nguyen Thi Phuong Lan⁽¹⁾, Nguyen Thi Kim Hoang⁽¹⁾,

Mai Nguyet Thu Huyen⁽²⁾, Nguyen Thi Ngoc Lan⁽²⁾, Nguyen Hong Duc⁽²⁾,

Maryvonne Maynart⁽³⁾ Yves Germani⁽³⁾, Truong Xuan Lien⁽¹⁾

(1) Pasteur Institute, HCM City

(2) Pham Ngoc Thach Hospital, HCM City

(3) Pasteur Institute, Paris

Bronchoalveolar lavage, induced sputum, and sputum were collected from each of thirty six HIV-positive patients manifesting pneumonia, and tested by PCR and immuno-fluorescent techniques to detect Pneumocystis jiveroci infection. The detection proportion of Pneumocystis jiveroci in bronchoalveolar lavage specimens was 64% by PCR and 53% by immunofluorescence. The figures among induced sputum and sputum by the two techniques were 53%, 36%, and 39%, 28%, respectively. There is no significant difference between the detection proportion of PCR and immunofluorescent techniques. PCR was found to be a useful tool for early detection of Pneumocystis jiveroci infection among HIV-positive patients.

Key words Pneumocystis jiveroci, HIV-positive patients, sputum, induced-sputum, bronchoalveolar lavage, PCR, immunofluorescent technique