NGHIÊN CỨU MIỄN DỊCH HIỂN VI ĐIỆN TỬ VÀ SIÊU CẤU TRÚC
CỦA VI RÚT ROTA TRÊN TẾ BÀO VERO VÀ TẾ BÀO THẬN KHỈ TIÊN PHÁT

Trần Quang Huy⁽¹⁾, Nguyễn Thanh Thuỷ⁽¹⁾, Nguyễn Thị Minh Liên⁽¹⁾, Nguyễn Văn Mẫn⁽²⁾,
I. Dunia⁽³⁾, E. L. Benedetti⁽³⁾

(1) Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương, Việt Nam, (2) POLYVAC, Việt Nam

(3) Institut Jacques Monod CNRS – Universites Paris 6 & 7, Paris, France

Tóm tắt

Miễn dịch hiển vi điện tử đã được chúng tôi áp dụng để xác định vị trí kháng nguyên vi rút rota tại các bào quan của tế bào Vero và tế bào thận khỉ tiên phát (TKTP) sau khi gây nhiễm cũng như để tìm hiểu sự tương tác giữa vi rút này và tế bào chủ. Trong nghiên cứu, chúng tôi sử dụng Protein A có gắn các hạt vàng (10nm) cùng với kháng thể đa dòng kháng trực tiếp các protein của vi rút rota. Hạt vàng với mật độ đậm đặc điện tử cao đã bộc lộ vị trí các kháng nguyên vi rút rota trong các tiêu thể, túi nhỏ và khoang của bào tương. Các hạt vi rút mới tổng hợp cũng có thể quan sát được sau khoảng 18 – 20 giờ gây nhiễm. Những thông tin rất có giá trị như quan sát thấy hạt vi rút và cả các hạt giống vi rút được tổng hợp vào trong khoang bào tương kết hợp với lưới nội bào và hệ thống Golgi.

Từ khóa: miễn dịch hiển vi điện tử, vi rút rota, siêu cấu trúc, kháng nguyên

I. Đặt vấn đề

Phương pháp miễn dịch hiển vi điện tử đã được tìm ra khoảng hơn 20 năm nay và được ứng dụng rất rộng rãi nhằm phát hiện và xác định một số loại vi rút trong các mẫu bệnh phẩm [2]. Ngày nay, phương pháp này là một công cụ rất quan trọng trong nghiên cứu hiển vi điện tử siêu cấu trúc sinh vật và đặc tính hóa miễn dịch tế bào [1-4]. Tuy nhiên, để sử dụng được phương pháp này cần trang bị các thiết bị đắt tiền và hóa chất chuyên dụng. Mặc dù vậy, những thông tin khoa học quan trọng và rất đáng tin cậy đã củng cố một vị thế vững chắc cho phương pháp này trong nghiên cứu siêu cấu trúc sinh vật mà các phương pháp khác không thể có được [2-6]. Thành phần protein của vi rút có khả năng được định vị bằng phương pháp miễn dịch âm bản hay miễn dịch trên lát cắt siêu mỏng [1,4,6]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử trên lát cắt siêu mỏng dùng Protein A gắn các hạt nano vàng để định vị một số protein thành phần của vi rút rota trên hai dòng tế bào Vero và tế bào thận khỉ tiên phát sau khi gây nhiễm với thời gian khác nhau. Trong điều kiện Việt Nam, chúng tôi sử dụng kháng thể đa dòng kháng các thành phần protein của vi rút rota để tìm hiểu sự tương tác giữa vi rút rota với tế bào chủ trong quá trình nhân lên của chúng sau khi gây nhiễm.

II. Vật liệu và phương pháp

2. 1. Vật liệu

Chủng vi rút rota G1P8 có ký hiệu KH0118 được phân lập từ phân bệnh nhi có triệu chứng tiêu chảy cấp, được cung cấp bởi POLYVAC, Việt Nam [5,6]. Tế bào thận khỉ tiên phát từ khỉ Macaca mulatta và tế bào Vero của WHO, do CDC-Hoa Kỳ cung cấp.

Môi trường nuôi tế bào: M199 nuôi tế bào Vero và 10% huyết thanh bê nuôi tế bào thận khỉ tiên phát, môi trường duy trì tế bào M199 không có huyết thanh bê, quá trình nuôi cấy và gây nhiễm vi rút trên tế bào được thực hiện tại POLYVAC [5,6].

Kháng thể đa dòng đặc hiệu kháng các protein của vi rút rota; Protein A gắn vàng (10nm).

Các hóa chất: 3% paraformaldehyde+0,2% glutaraldehyde trong đệm PBS pH 7,2 – 7,4; PBS 1x; BSA/ PBS 2%; 0,5%; 0,2%; NH4Cl 0,05M; cồn 500, 700, 800, 900, 1000; Propylen oxyde; dung dịch OsO4 1%; Chất đúc LR White; thuốc nhuộm Uranyl acetate 5%, 2%; Chì Citrate; lưới Nikel 200 mắt đã phủ màng collodion-các bon …

Các thiết bị phòng thí nghiệm dùng để nuôi cấy vi rút, chuẩn bị mẫu, máy cắt siêu mỏng Ultramicrotome LKB-8800, kính hiển vi điện tử truyền qua JEM1010 (KHVĐT)

2. 2. Phương pháp

Sau khi đã gây nhiễm vi rút rota với thời gian khác nhau, chúng tôi cố định tế bào với 3% paraformaldehyde+0,2% glutaraldehyde trong đệm PBS pH 7,2 – 7,4 trong vòng 1giờ rồi qua các bước rửa bằng PBS 1x, NH4Cl 0,05M, hút nước bằng cồn 500, 700, 800, 900, 1000; tẩm bằng propylen oxyde, đúc bằng LR White, cuối cùng là làm cứng trong tủ ấm 40 – 450C, từ 24 – 36 h, [1, 6].

Sau khi mẫu đủ cứng được cắt thành những lát cắt siêu mỏng cỡ 60 – 80nm trên máy cắt LKB-800, các lát cắt này được đỡ trên lưới Nikel có màng collodion-các bon. Qui trình làm miễn dịch được thực hiện theo các bước sau trong một đĩa petri [1,5,6]. Nhỏ các giọt với thể tích khoảng 20 – 40 micro lít trên dải parafin sạch.

Qui trình:

-        Lưới có lát cắt được rửa bằng 2 – 3 giọt PBS pH-7,2.

-        Đặt nổi trên giọt PBS-BSA 2% trong 20 phút để phóng bế các vị trí kháng nguyên không đặc hiệu.

-        Các lưới này ngay lập tức lại được chuyển tới giọt kháng thể đa dòng kháng vi rút rota đã pha loãng trong PBS-BSA 0,5% và ủ trong 30 – 45 phút.

-        Rửa kỹ bằng PBS-BSA 0,2%.

-        ủ tiếp trong protein A gắn vàng (10nm) đã pha loãng trong 30 – 45 phút.

-        Rửa trên các giọt PBS 1x.

-        Cố định bằng hơi OsO4 trong 1 giờ.

-        Rửa kỹ trên các giọt nước cất 2 lần.

-        Nhuộm với uranyl acetate 2% trong 5 phút.

-        Rửa kỹ trong nước cất 2 lần và để khô.

-        Nhuộm với chì citrat 1% trong 30 giây.

-        Rửa bằng nước cất 2 lần và để khô chờ quan sát.

Các lưới sau khi đã thực hiện phản ứng miễn dịch gắn vàng được quan sát dưới kính hiển vi điện tử truyền qua JEM1010, độ phân giải 2A° tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

III. Kết quả và bàn luận

Bằng phương pháp hiển vi điện tử và các thử nghiệm miễn dịch gắn vàng chúng tôi đã quan sát thấy các hạt vi rút rota tiếp cận với màng tế bào (hình 1A), trên hình này có rất nhiều các hạt vi rút tập trung giữa hai vi nhung mao và màng tế bào, quá trình tiếp cận này có thể xảy ra ngay sau khi gây nhiễm khoảng vài phút. Phần cấu trúc bào tương bên trong tế bào còn tương đối nguyên vẹn. Tại những vị trí có sự xuất hiện của vi rút đều được các hạt vàng chỉ điểm. Các hạt vàng bao bọc xung quanh vi rút, đó là do phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên bề mặt vi rút rota với kháng thể kháng các thành phần protein của vi rút rota, còn kháng thể này lại được kết hợp với Protein A gắn vàng. Giai đoạn tiếp theo là vi rút xâm nhập vào trong bào tương cũng được quan sát khá rõ, một phần cáp xít của vi rút đã bị hòa với màng của tế bào, chứng tỏ vi rút vào trong tế bào bằng cơ chế thẩm thấu nhanh (hình 1B). Quan sát trên những tế bào gây nhiễm vi rút rota sau 30 và 90 phút cho thấy các hạt vàng gắn trên từng vùng màng tế bào, chứng tỏ quá trình tổng hợp các protein thành phần của vi rút được tổng hợp rất nhanh và đã dịch chuyển tới vị trí màng tế bào. Ngoài ra, chúng tôi còn quan sát thấy các protein này còn tập trung rất nhiều trong các túi nhỏ, khoang bào tương (hình 1C). Trên tế bào khác, các protein của vi rút rota sắp xếp xung quanh mặt phía bên trong của màng khoang bào tương sẵn sàng cùng với các protein không cấu trúc, vật liệu di truyền ARN tổng hợp thành các vi rút hoàn chỉnh hoặc không hoàn chỉnh vào bên trong khoang này (hình 1D). Sự định vị chính xác các protein này trên tế bào chỉ sau khoảng 18 đến 20giờ sau gây nhiễm. Đáng lưu ý là các hạt vi rút và các hạt giống vi rút được tổng hợp vào trong các túi nhỏ của bào tương kết hợp với lưới nội bào và hệ thống Golgi (hình 1D)

Hình 1: A-Các hạt vi rút đang tiếp cận tới sát màng tế bào, giữa hai vi nhung mao của tế bào Vero. B-Các hạt vi rút được định vị bởi các hạt vàng bao xung quanh trong quá trình xâm nhập vào trong tế bào TKTP. C-Các hạt vàng định vị protein lớp cáp xít ngoài của vi rút rota trên một phần bề mặt tế bào Vero và trong các khoang nhỏ của bào tương. D-màng của các khoang trong bào tương được gắn bởi các hạt vàng, điều này khẳng định sự có mặt các protein của vi rút rota tại các vị trí này. Thước đo: A, B, và D tương ứng là 150nm và C là 180nm.

Trên dòng tế bào TKTP sau khi gây nhiễm vi rút 30 phút tại 37°C, chúng tôi làm mẫu và thực hiện phản ứng miễn dịch gắn vàng với kháng thể kháng các thành phần protein của vi rút, quan sát các lát cắt siêu mỏng cho thấy nhiều hạt vàng tập trung trên bề mặt của tế bào nơi tiếp giáp với những phần tế bào bị thừa ra, chứng tỏ tại các vị trí này tập trung rất nhiều protein thành phần của vi rút rota, nhưng bào tương của tế bào còn tương đối nguyên vẹn, chưa bị phá hủy. Đây chính là giai đoạn đầu quá trình nhân lên của vi rút rota trên dòng tế bào này, các protein được tổng hợp và di chuyển tới vị trí thích hợp tại bề mặt của màng bào tương và màng của các khoang trong bào tương để thuận tiện cho quá trình kết hợp với các thành phần khác tổng hợp nên các hạt vi rút rota. Quan sát trên hình ảnh hiển vi điện tử, phần tế bào tiếp giáp với tế bào chính trông giống như những chỗ bị “phồng rộp” (hình 2).

Hình 2. Hạt vàng tập trung trên bề mặt tế bào tại các vị trí “phồng rộp” của tế bào. Thước đo: 150nm

Ngoài ra, các kháng nguyên của vi rút rota còn được định vị trong các túi nhỏ hay trong các cấu trúc ống của một số tế bào TKTP khác (hình 3).

Hình 3. Hạt vàng định vị kháng nguyên vi rút rota trong những túi nhỏ và cấu trúc ống của tế bào thận khỉ tiên phát. Thước đo: 200nm

Những thông tin trên phần nào đã cho chúng ta cái nhìn khái quát về khả năng ứng dụng của miễn dịch hiển vi điện tử trong nghiên cứu siêu cấu trúc và đặc tính hóa miễn dịch tế bào. Tuy nhiên, để có thể khai thác thông tin nhiều hơn và hiểu rõ cơ chế tương tác của vi rút và tế bào chủ thì việc sử dụng phương pháp này cùng với các kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho từng thành phần protein của vi rút cũng như tế bào là rất cần thiết.

IMMUNOELECTRON MICROSCOPIC AND ULTRASTRUCTURAL STUDY OF ROTAVIRUS IN VERO CELLS AND PRIMARY MONKEY KIDNEY CELLS

Tran Quang Huy⁽¹⁾, Nguyen Thanh Thuy⁽¹⁾, Nguyen Thi Minh Lien⁽¹⁾, Nguyen Van Man⁽²⁾,
I. Dunia⁽³⁾, E. L. Benedetti⁽³⁾

(1) National Institute of Hygiene and Epidemiology, Vietnam

(2) POLYVAC, Vietnam

(3) Institut Jacques Monod CNRS – Universites Paris 6 & 7, Paris, France

Abstract

Immunoelectron microscopy have been developed to identify antigens of rotavirus that localize to subcellular organelles or compartments of Vero cells and primary monkey kidney cells after infection as well as to study rotavirus-host cell interaction by using the Protein A gold (10nm) and polyclonal antibody directed against Rotavirus proteins. The complete process of progressive transfer of non-particulate viral antigenic material was followed by immunogold labeling which revealed that labeled material was present into endosomal and lysosomal compartments. Newly assembled viral particles could be identified only after 18 – 20 hours post-infection. It is also noteworthy that viral particles and empty capsides (virus like particles, VLP) were comprised into cytoplasmic vesicles associated with the endoplasmic reticulum (ER)-Golgi system.

Keywords: immunoelectron microscopy, rotavirus, ultrastructure, antigen.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.      M. A. Hayat. Principle and techniques of electron microscopy. Macmillan Press, 1989.

2.      S. Lasarova et al. Immunoelectronmicroscopic detection and idetification of viruses in biological fluids. E. Pathology. Bungarian Academy of Sciences. 6/12. , 2003. , pp. 34-39.

3.      Nguyen Van Man et al. Immunocytochemical study of the rotavirus interaction with host cells in culture. , Pr of the 4^th ASEAN microscopy Conference. , 2003. , pp. 6-10.

4.      Shahin Ahmadian. , Ultrastructural Study of Rotavirus Replication and Localization of the Intermediate Capsid Protein VP6. , Iran. Biomed. J. 7 (1), 2003, pp. 7-11.

5.      Nguyễn Minh Liên, Trần Quang Huy, Nguyễn Thanh Thủy. , Một số đặc trưng siêu cấu trúc của vi rút rota trên tế bào vero và tế bào thận khỉ tiên phát. Những vấn đề cơ bản của khoa học sự sống 2005. Đại học Y Hà Nội, 2005, trang 1285-1287.

6.      Nguyễn Thanh Thủy, Nguyễn Thị Minh Liên và cs. Sự thích nghi của chủng vi rút rota KH0118 trên hai dòng tế bào Vero và tế bào thận khỉ tiên phát-quan sát kính hiển vi điện tử. Tạp chí Y học dự phòng, 2005, tập XV, số 6 (77), trang 11-14.