ÁP DỤNG KỸ THUẬT PCR-RFLP
ĐỂ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ VI KHUẨN LÀ CĂN NGUYÊN CHÍNH
GÂY VIÊM MÀNG NÃO Ở TRẺ EM

Lê Nhật Minh, Phan Lê Thanh Hương, Lê Thị Kim Tuyến

Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương, Hà Nội.

Nghiên cứu xác định chính xác căn nguyên vi khuẩn gây viêm màng não ở trẻ em đang là một vấn đề cần được quan tâm. Mục tiêu: áp dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định một số căn nguyên vi khuẩn gây viêm màng não ở trẻ em. Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu sử dụng các mẫu vi khuẩn chuẩn và mẫu dịch não tủy của trẻ nghi viêm não do vi khuẩn được cung cấp từ phòng thí nghiệm Hô hấp và viêm màng não vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW. Nghiên cứu sử dụng một cặp mồi được thiết kế dựa trên vùng gen mã hóa cho yếu tố 16S ribosom chung cho 10 loài vi khuẩn là căn nguyên chính gây viêm màng não vi khuẩn ở trẻ em. Đoạn ADN khuếch đại có kích thước 996bp bằng PCR được cắt bằng enzym giới hạn Hae III. Những hình vạch ADN khác nhau cho phép xác định được loài vi khuẩn nào là căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em. Kết quả: đã xây dựng và chuẩn hóa được phương pháp PCR-RFLP có khả năng phân biệt được chính xác 10 loài vi khuẩn khác nhau là những căn nguyên chính gây viêm màng não vi khuẩn ở trẻ em. Kết luận: kỹ thuật PCR-RFLP sử dụng một cặp mồi chung cho phép nhân lên một đoạn ADN có kích thước 996 bp trên gen mã hóa cho yếu tố 16S ribosom với độ nhậy và độ đặc hiệu cao. Kỹ thuật RFLP cho phép xác định chính xác 10 loài vi khuẩn là căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em.

Từ khóa: PCR-RFLP, Viêm màng não vi khuẩn, 16S ribosom

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Ở Việt nam cũng như các nước đang phát triển, một trong những bệnh nhiễm trùng có tỷ lệ tử vong cao là viêm màng não vi khuẩn (VMNVK) {3, 4}. VMNVK là một trong những bệnh nhiễm khuẩn hay gặp nhất ở trẻ em {2, 4}. Đó là trình trạng bệnh lý gây nên do các vi khuẩn có khả năng sinh mủ, xâm nhập vào màng não với bệnh cảnh lâm sàng chủ yếu là hội chứng nhiễm trùng cấp và hội chứng não-màng não{4}.

Những vi khuẩn gây VMNVK rất đa dạng. Theo các tài liệu nước ngoài và Việt nam đã công bố thì có 3 loài vi khuẩn gây VMNVK thường gặp ở trẻ em là: Haemophilus influenzae, Neisseria meningiditis và Streptococcus pneumoniae {1, 2, 5}. Ngoài ra các loại vi khuẩn khác cũng gây VMNVK ở trẻ em như: Liên cầu, Escherichia coli. Staphyloccus aureus, pseudomonas, Enterobacter {6}… Xác định chính xác căn nguyên gây VMNVK và sự nhậy cảm với kháng sinh của vi khuẩn giúp cho các thầy thuốc lâm sàng lựa chọn phương pháp điều trị thích hợp, đặc hiệu với vi khuẩn nhằm giúp cho việc điều trị kịp thời, có hiệu quả, hạ thấp tỷ lệ tử vong và dị chứng của bệnh {3, 4, 5}.

Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphim) hay còn gọi là phương pháp đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn là một trong những kỹ thuật sinh học phân tử có độ đặc hiệu và độ nhậy cao cho phép xác định nhanh chóng và chính xác sự có mặt của không chỉ một loài vi khuẩn mà còn cho phép xác định và phân biệt nhiều loài vi khuẩn là căn nguyên gây VMNVK {5, 9, 10}. Nghiên cứu được giới thiệu dưới đây nhằm mục tiêu: áp dụng phương pháp PCR-RFLP để xác định một số căn nguyên vi khuẩn gây viêm màng não ở trẻ em.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2. 1. Đối tượng:

Mẫu vi khuẩn chuẩn được cung cấp từ Phòng Thí nghiệm Hô hấp và viêm màng não vi khuẩn, Viện Vệ sinh Dịch tễ TW.

Các hóa chất chuẩn của các hãng New England Biolab, Invitrogen, Sigma, Promega…

2. 2. Phương pháp nghiên cứu

Toàn bộ ADN vi khuẩn chuẩn nuôi cấy trên đĩa thạch được tách theo thường qui của Bộ Kít DNA Qiagen. Phản ứng PCR với cặp mồi được thiết kế trên vùng gen mã hóa cho yếu tố 16S ribosom là chung cho 10 loài vi khuẩn khác nhau. Sản phẩm PCR có kích thước 996bp được kiểm tra kết quả trên gel agaroza 1% cùng với thang ADN chuẩn, nhuộm Ethidium bromit và quan sát dưới đèn cực tím. Sản phẩm sau phản ứng PCR, tiếp tục tiến hành phản ứng phân tích đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP) với enzym giới hạn HaeIII. Kiểm tra kết quả trên gel agarose low melting 3% và nhuộm BEt.

III. KẾT QUẢ

3. 1. Phản ứng PCR

Kỹ thuật PCR với cặp mồi chung được thiết kế dựa trên vùng ADN mã hóa cho yếu tố 16S ribosom chung cho 11 loài vi khuẩn khác nhau cho phép nhân lên đoạn ADN có kích thước
996 bp.

3. 2. RFLP để xác định các chủng vi khuẩn chuẩn

Sản phẩm ADN dài 996bp của 10 loài vi khuẩn chuẩn khác nhau được phân tích đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn sử dụng enzym giới hạn Hae III. Các hình vạch ADN sau khi xử lý với enzym giới hạn Hae III, cho phép phân biệt được các loài vi khuẩn gây viêm màng não
(Hình 2).

IV. BÀN LUẬN

Trong nghiên cứu này một cặp primer được sử dụng để nhân lên đoạn sản phẩm PCR dài 996bp của yếu tố 16S ribosom cho 11 loài vi khuẩn khác nhau. Thực tế là các loài vi khuẩn này rất khác nhau về vật liệu di truyền, trình tự các nucleotit trong bộ genom. Tuy nhiên, trong quá trình tiến hóa các loài vi khuẩn vẫn duy trì những đặc điểm chung như quá trình sao mã, phiên mã và dịch mã tổng hợp protêin của tế bào. Điển hình là các gen mã hóa cho các ARN ribosom như 16S, 23S, 5S. Trong nghiên cứu này, sản phẩm PCR có độ dài 996bp trên gen mã hóa cho các yếu tố ARN ribosom 16S của 11 loài vi khuẩn được nhân lên với một độ nhậy và độ đặc hiệu thích hợp. Kết quả PCR cũng cho phép sơ bộ kết luận về sự tồn tại của một trong những loài vi khuẩn là căn nguyên gây viêm màng não trong các mẫu bệnh phẩm DNT.

Việc xác định chính xác từng loài vi khuẩn khác nhau được thực hiện nhờ enzym giới hạn. Enzym giới hạn là một loại protein có khả năng nhận ra và cắt phân tử ADN ở những vị trí đặc hiệu. Như chúng ta đã biết, sản phẩm PCR là một đoạn ADN nằm trên gen mã hóa cho yếu tố 16S của ARN ribosom là đặc trưng cho nhóm vi khuẩn và có tính bảo thủ cao. Tuy nhiên đối với từng loài vi khuẩn khác nhau trên đoạn ADN có tính bảo thủ cao này vẫn có những sự khác nhau ở một vài nucleotid và chính những sự khác nhau này đã cho phép enzym giới hạn nhận ra và xúc tác cho các phản ứng cắt đoạn ADN nay thành những đoạn ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau. Với từng loài vi khuẩn do sự khác nhau ở những vị trí nucleotid nhất định là vị trí nhận biết và cắt của enzym giới hạn sẽ tạo nên sự khác nhau về độ dài và kích thước của các đoạn ADN do enzym giới hạn để lại.

Trong nghiên cứu của chúng tôi một enzym giới hạn là Hae III nhận ra trình tự nucleotid là GGCC đã được sử dụng để phân tích sự đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn trên đoạn ADN là sản phẩm PCR. Kết quả thể hiện ở Hình 2 sau khi phân tích hình vạch ADN của các loài vi khuẩn chuẩn trên gel agarose low melting 3% cho phép chúng tôi xác định được sự khác nhau của 10 loài vi khuẩn khác nhau là những loài vi khuẩn chính trong những căn nguyên vi sinh vật gây VMNVK. Kết quả này cho phép chúng tôi tiến hành phân tích trên mẫu dịch não tủy (DNT) để xác định nhanh chóng, chính xác một số căn nguyên vi khuẩn chính gây viêm màng não ở trẻ em.

V. KẾT LUẬN

Kỹ thuật PCR sử dụng một cặp mồi chung cho phép nhân lên một đoạn ADN có kích thước 996 bp trên gen mã hóa cho yếu tố 16S ribosom với độ nhậy và độ đặc hiệu cao. Kỹ thuật RFLP cho phép phân biệt được 11 loài vi khuẩn chuẩn khác nhau và xác định chính xác 9 loài vi khuẩn là căn nguyên chính gây viêm màng não ở trẻ em.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.      Đặng Đức Anh, Phan Lê Thanh Hương, Nguyễn Lan Hoa, Nguyễn Công Khanh, Nguyễn Hiền Anh, Hoàng Thủy Long: ”Viêm màng não vi khuẩn tại Hà nội, 2000 – 2002. Tạp chí Y học dự phòng, Tập XII, số 3 (54) năm 2002.

2.      Đặng Đức Anh: Tỷ lệ nhiễm Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae và các virus hô hấp ở bệnh nhân nhi dưới 5 tuổi viêm nhiễm đường hô hấp. Tạp chí y học dự phòng, Tập XIV, số 4 (68) năm 2004.

3.      Bùi Đại, Nguyễn Văn Âu: Nhiễm khuẩn do màng não cầu. Bách khoa thư bệnh học, tập 1 1991, trang 195 – 200.

4.      Chu Văn Tường: Bệnh viêm màng não ở trẻ sơ sinh. Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học (1980 – 1985) Viện bảo vệ sức khỏe bà mẹ và trẻ em.

5.      Hoàng Thủy Long: Nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính ở trẻ em căn nguyên và lựa chọn phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm. Tuyển tập CTNCKH Viện VSDTTƯ, 1997 – 2000.

6.      Ngô Thi Thi: Tìm hiểu căn nguyên vi khuẩn gây viêm màng não mủ cấp ở trẻ em dưới 5 tuổi tại Viện bảo vệ sức khỏe trẻ em từ 1988 – 1992. Luận án phó tiến sĩ y dược, 1994.

7.      Phan Lê Thanh Hương: Góp phần chẩn đoán sớm viêm màng não mủ do Haemophilus influenza týp b ở trẻ em dưới 5 tuổi, Tạp chí y học dự phòng, Tập III, số 4 (61) năm 2003.

8.      Phan Lê Thanh Hương: Haemophilus influenza týp b mối liên quan giữa các chủng gây bệnh ở mức độ phân tử, tạp chí y học dự phòng, tập XIV số 5(69) năm 2004.

9.      Backman A, Lantz P, Radstrom P, Olcen P. Evaluation of an extended diagnostic PCR assay for detection and verification of the common causes of bacterial meningitis in CSF and other biological samples. Mol Cell Probes. 1999 Feb;13(1): 49-60.

10.  Lu JJ, Perng CL, Lee SY, Wan CC. Use of PCR with universal primers and restriction endonuclease digestions for detection and identification of common bacterial pathogens in cerebrospinal fluid. J Clin Microbiol. 2000 Jun;38(6): 2076-80.

APPLYING THE PCR-RFLP FOR DETECTION AND IDENTIFICATION OF SOME COMMON BACTERIAL PATHOGENS OF MENINGITIS IN CHILDREN

Le Nhat Minh, Phan Le Thanh Huong, Le Thi Kim Tuyen

National Institute of Hygiene and Epidemiology

Investigator to quickly and exactly detect bacterial meningitides in children’s has been concerning. Objective: this study to apply a PCR-RFLP method to detect mainly bacterial cause of bacterial meningitides. Methods: standard bacterial from respiratory and meningitides bacterial laboratory, National Institute of Hygiene and epidemiology (NIHE) was used in this study to. We have used a universal PCR capable of amplifying a portion of the 16S reran gene of eubacteria, including Staphylococcus aurous, Staphylococcus epidermidis, Steptococcus pneumoniae, Enterococcus faecium, Entercoccus faecalis, Mycobacterium tuberculosis, Legionella pneumoniae, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanni, Proteus mirabilis, Haemophilis influenza and Neisseria lactaminea. The size of the amplified products from various bacteria were the same (996bp), but the restriction patterns of most PCRs products generated by Hae III digestion were different. Results: has been building and dopamine PCR–RFLP method to detect and character 10 species bacterial is mainly cause of bacterial meningitides in children’s. Conclusions: the results were permitted to characterize and identification of 10 bacterial and apply to directly detect bacterial at children’s CSF samples is common bacterial pathogens in bacterial meningitides syndrome in children.